中药单体复方对60Co-γ致雄性小鼠生精功能障碍的治疗

摘要：目的：观察中药单体复方（白藜芦醇、枸杞多糖、槲皮素和L-肉碱）促进60Co-γ致小鼠睾丸生精障碍后生精功能的恢复作用，并探讨其最佳剂量。方法：72只雄性昆明小鼠随机分为5组，A组（n=12）正常喂饲，B、C、D、E组（各15只）小鼠均采用60Co-γ 6 Gy全身均匀照射1次，构造小鼠睾丸生精障碍模型，1周后开始对C、D、E组分别用40、80、160mg/(kg·d〕浓度的中药单体复方混悬液灌胃35天，A组和B组给予等量生理盐水。同时记录小鼠的一般状况、体征及体重变化和实验结束时睾丸重量及睾丸脏器指数；酶联免疫法测定血清FSH、LH、T和E2水平并计算T/E2比值；对睾丸组织进行组织学观察。结果：D组〔80mg/(kg·d〕〕小鼠体重、睾丸重量及睾丸指数均较B组有明显改善（P<0.05），接近A组（P>0.05），C组和E组虽有所改善但仍低于A组（P<0.05）。C、D、E组小鼠血清生殖激素水平均有一定程度的恢复，但D组各生殖激素指标均接近A组（P>0.05）。组织学观察见各给药组睾丸生精小管生精细胞层数、精子数目及c-kit阳性表达均高于B组，尤以D组〔80mg/(kg·d〕〕恢复最为明显。结论：中药单体复方制剂能够促进60Co-γ致小鼠睾丸生精功能障碍后生精功能的恢复，且最佳剂量为80mg/(kg·d〕。郑州大学第一附属医院男科王瑞
中图分类号 R689+.2
Compound Chinese Herbal Monomer Recipe For Testis Spermatogenic Disturbance In Male Mice Induced By 60Co-γ
WANG Rui,HE Wei,ZHANG Wei-xing,WANG Hua-li,LI Rui,GAO Changhui
Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, the Key-Disciplines Laboratory Clinical-Medicine Henan,the Institute of Molecular Cancer Surgery at Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China
Correspondence to:WANG Rui,E-mail:huzi918@hotmail.com

Abstract: objective: To study the effect of Compound Chinese Herbal Monomer Recipe which were made of resveratrol、lycium barbarum polysaccharide(LBP)、quercetin and L-camitine on spermatogenic disturbance in mice induced by 60Co-γ, and to explore the best effective dose. Methods: seventy-two male Kunming mice were randomly divided into five groups. Group A (n = 12)were normally raised and models of spermatogenic disturbance were established by the irradiation of the 60Co-γ with 6 Gy in Group B、C、D and E（15 each）.After a week, Group C、D and E received intragastric administration of Compound Chinese Herbal Monomer Recipe of different concentrations (40、80 and 160 mg/(kg.d),respectively)for 35 days,and the rest two groups received physiological saline. Then the general condition、physical sign and body weight of mice were recorded,and after finishing gavage, the weight of testes were measured and the testicular organ index were calculated; the levels of FSH, LH, T and E2 determined by enzyme-linked immunosorbent assay and the ratio of T/E2 were calculate; Histological observation of the testis tissues were done under the microscope.Result: Compared with those of Group B, the body weight、the testis weight and the testis index of Group D〔80 mg/(kg·d〕〕 were improved obviously(P<0.05)and close to those of Group A(P>0.05); those of Group C and E were improved, but were still lower than those of Group A(P<0.05). The levels of the serum reproductive hormone of Group C、D and E had some degree of recovery, but those of Group D were close to normal(P>0.05).The layers of spermatogenic cells、the number of sperm and the positive expression of c-kit in spermatogenic tubules of Group C、D and E were superior to those of Group B, especially in Group D(80 mg / (kg o d)). Conclusion : Compound Chinese Herbal Monomer Recipe could promote effectively the recovery of spermatogenic disturbance in mice induced by 60Co-γ, and the best dose was 80mg / (kg o d).
Key words: Compound Chinese Herbal Monomer Recipe;  60Co-γ; Male sterility; reproductive hormone; treatment

    男性不育症的病因甚为复杂，其原因可能有环境因素、生活习惯、遗传因素、生理疾病及心理疾病等[1]。研究发现：环境辐射可直接或间接地造成睾丸及附属腺体受损、内环境紊乱进而生精功能障碍，从而影响精子质量[2]。睾丸对辐射尤为敏感，小剂量照射就会导致精子减少、精子活力下降以及性功能降低[3]。目前，现代医学对少精、弱精症的治疗尚缺乏特异有效的方法，而利用中药的有效单体成分组成的复方制剂在治疗雄性不育方面的报道尚不多见。本实验采用60Co-γ照射致雄性小鼠睾丸生精功能障碍，用白藜芦醇、枸杞多糖、槲皮素、L-肉碱四种中药单体组成的复方制剂进行干预，评价中药单体复方制剂对雄性不育的疗效,现报告如下。

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 普通级健康雄性昆明小鼠72只，6～8周龄，20～25g，购自河南省实验动物中心。
1.1.2 实验药物 中药单体复方：白藜芦醇、枸杞多糖、槲皮素、L-肉碱，由陕西森弗生物技术有限公司提供；羧甲基纤维素钠购自郑州市万利来食品添加剂有限公司（食品级）。
1.1.3 主要试剂及设备 兔抗小鼠c-kit（CD117）、SABC（兔IgG）-POD试剂盒、DAB显色试剂盒(黄)，以上三种均购自武汉博士德生物工程有限公司；生殖激素系列（FSH、LH、T、E2）酶联免疫试剂盒（UNIONHONEST#ADL）；FCC-8000型同中心回转式钴60治疗机（山东新华医疗器械股份有限公司，郑州大学第一附属医院放疗科）；倒置显微镜（日本Nikon公司）；台式高速低温离心机（HERAEUS公司）；电子分析天平（STARTORIUS公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 72只雄性昆明小鼠适应性喂养2周后，随机分为5组，依次为：A组（正常组）12只、B组（造模对照组）、C组（中药单体复方低剂量组）、D组（中药单体复方中剂量组）E组（中药单体复方高剂量组）各15只。
1.2.2 造模方法 除A组（正常组）外，其余各组均采用60Co-γ 6 Gy全身均匀照射1次，照射时间：512秒。
1.2.3 给药方法 造模后喂养1周，待各组小鼠一般状况稳定后开始对C组、D组、E组小鼠分别灌胃不同浓度的、用0.5%羧甲基纤维素钠配制的中药单体复方制剂低剂量〔40mg/(kg·d〕〕、中剂量〔80mg/(kg·d〕〕、高剂量〔160mg/(kg·d〕〕溶液，正常组和造模对照组灌胃等量0.5%羧甲基纤维素钠的生理盐水，每天1次，连续灌胃35天。并记录各组小鼠的外貌体征，活动情况及体重变化。
1.3 观察指标
1.3.1 一般体征观察 观察记录小鼠造模后外貌体征、精神、活动情况，饮食和体重变化等。
1.3.2 睾丸重量测定 取血后，颈椎脱臼法处死小鼠，取双侧睾丸，用冷生理盐水冲洗，除去血液，滤纸滤干，电子分析天平称重。记录睾丸重量并计算睾丸脏器指数。睾丸脏器指数（g/kg）=睾丸重量（g）/试验后小鼠体重（kg）。
1.3.3 生殖激素测定 灌胃结束后24小时，将全部雄性小鼠摘眼球取血，分离血清，用酶联免疫法测定血清FSH、LH、T和E2水平，计算T/ E2比值。
1.3.4 睾丸组织形态的观察 取小鼠左侧睾丸，用Bouin\\"s固定液固定后石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色，光镜下观察生精小管形态和精子发生状态，包括生精小管、精子、生殖细胞的层次分析。
1.3.5 免疫组化 取小鼠右侧睾丸，用Bouin\\"s固定液固定后石蜡包埋，切片，山羊血清封闭，室温孵育，加入一抗，过夜后加入二抗，加入显色剂，脱水复染，封片，光镜下观察精原细胞标记物c-kit表达情况。
1.4 统计学分析 应用SPSS10.0统计软件进行处理，采用方差分析，结果以 ±s表示。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果 
    2.1 一般体征观察  65只小鼠进入结果分析。实验中B、C、E组各死亡2只小鼠，D组死亡1只小鼠。B、C、D、E组小鼠接受60Co-γ单次全身照射后第二天开始，出现精神不振、四肢无力、活动迟缓、蜷缩少动及食欲下降，体毛毛色暗淡并有脱毛现象，皮肤松弛，体重开始下降等，C、D、E组服用不同浓度的中药单体复方制剂35d后上述体征均不同程度得到改善，而B组小鼠体征改善不明显，且体重无明显变化；A组小鼠一般情况良好，体毛光滑，体重逐渐增加；各组小鼠灌药结束后体重变化见表1。
2.2 灌药后睾丸重量及睾丸指数测定 
表1 各组小鼠睾丸重量及睾丸指数的测量结果（ ±s）
组别 n 小鼠体重 (g) 睾丸重量 (g) 睾丸指数 (g/Kg)
A 12 40.88±2.11* 0.20±0.03* 5.07±1.39*
B 13 35.91±4.63# 0.15±0.02# 3.51±0.15#
C 13 37.27±2.77# 0.16±0.01# 3.61±0.86#
D 14 39.21±3.23* 0.18±0.03* 4.16±0.45*
E 13 38.43±2.85* 0.16±0.01# 3.73±0.17#
与B组比较，*：P<0.05；与A组比较，#：P<0.05
2.3生殖激素测定
表2 各组小鼠血清FSH、LH、T、E2和T/ E2的测定结果（ ±s）
组别 n FSH(ng/mL) LH(ng/mL) T(ng/mL) E2(pg/mL) T/ E2(·103)
A 12 7.55±1.23* 8.52±4.43* 19.37±2.67* 33.55±13.10* 0.49±0.21*
B 13 11.64±1.76 17.08±4.98 14.70±0.62 65.64±20.90 0.21±0.04#
C 13 9.89±2.27*▲ 10.11±2.93* 15.49±2.35#▲ 43.84±10.22* 0.31±0.05#
D 14 7.67±1.20* 8.24±2.54* 19.86±3.45* 39.44±14.47* 0.43±0.18*
E 13 8.98±1.69* 9.05±2.66* 16.29±4.21▲ 38.32±13.00* 0.31±0.08#
与B组比较，*：P<0.05；与A组比较，#：P<0.05；与D组比较，▲： P<0.05
2.4 睾丸组织形态观察
    如图1：A组小鼠睾丸呈正常组织形态表现：生精小管边界整齐，各级生精细胞排列紧密，层次明显，可见各级生精细胞和大量精子；间质内未见异常，Johnsen评分均在9~10分。c-kit表达呈现阶段性，即从生精小管外层到内层，分化型A型、B型及早期的前细线期精母细胞显示c-kit染色阳性，从细线期精母细胞以后显示阴性。B组见生精小管基底膜变薄，生精细胞数目及层次明显减少，可见支持细胞和少量精原细胞，排列紊乱，管腔内精子少见，少部分管腔仅见支持细胞或者生精细胞脱落现象，间质内细胞数目明显减少，间质水肿，Johnsen评分在4~6分。大部分管腔生精细胞发育停滞，c-kit染色呈阴性。C组大部分生精小管内可见各级生精细胞及少量精子，但细胞数目较少，排列欠规则，间质内仍可见水肿，Johnsen评分在5~7分。部分生精小管生精细胞膜出现c-kit表达，且没有明显的阶段性，说明生精小管还没有完全恢复。D组大部分生精小管均可见各级生精细胞，数目明显增多，排列规则，层次分明，管腔内可见较多成熟精子，间质内细胞数目增多，水肿及炎性细胞浸润明显减轻，Johnsen评分在8~9分。生精细胞膜上c-kit表达与A组基本一样并呈现出阶段性。E组大部分生精小管内可见各级生精细胞且数目较低剂量组稍多，细胞层次也有所增加，管腔内可见成熟精子，间质内细胞数目增多，水肿减轻，Johnsen评分在6~8分。大部分生精小管可见c-kit表达，少部分生精小管c-kit表达呈现阶段性。
3.讨论
    钴60是一种穿透力很强的放射性核素，发射伽玛射线，广泛应用于工业上料位、密度测量、食品辐照保藏以及医疗上肿瘤的治疗等。同时它也在无形中给人们的健康造成危害。其中生殖系统的性腺组织对放射线较敏感，尤其是迅速分裂的二倍体精原细胞对放射线极为敏感，且损伤程度与吸收总量呈正相关[4]。本实验采用60Co-γ 6Gy对小鼠全身均匀照射，表1和表2显示造模对照组与正常组各指标相比，小鼠体重、睾丸重量和睾丸指数差异显著( P < 0.05 ) , 小鼠血清FSH、LH 和E2水平显著升高（P <0.05），T水平及T/ E2比值显著下降（P <0.05），这是由于小鼠接受全身照射后，反馈性的引起血清FSH 和LH水平不同程度的升高，同时间质细胞受损使其分泌的T水平下降，从而导致睾丸生精的内分泌环境紊乱[5]；而睾丸生精功能紊乱伴有FSH升高时，可刺激支持细胞合成E2的功能增加，使E2水平显著升高[6]。直接或间接的反应出了60Co-γ对小鼠睾丸生精细胞、支持细胞和间质细胞的显著损伤作用，而睾丸组织病理结果也再次印证了这一结果，且在35天内未恢复正常。
    中医中药对男性不育症的治疗十分有效，中医认为,肾为先天之本，肾的主要生理功能主藏精、主生长发育和生殖，开窍于耳及二阴。其所藏的先天之精是生殖发育的根本，精子的生成有赖于肾阴的滋养和肾阳的温煦；若肾阳不足则鼓动无力，肾精亏损则无精可调。研究表明[5]，肾虚与血瘀为男性不育的主要病机，中医的肾类似于下丘脑-垂体-性腺轴的的作用，肾气的盛衰体现了机体主要内分泌的功能状态及体质的状况；而血瘀往往反映出慢性炎症、组织损伤基础上的血运不畅、组织失养；故在治疗上以活血化瘀、滋补肾阴为主治疗少精子症，以活血化瘀、温补肾阳为主治疗弱精子症[7]。肾虚或责之精气清冷，或隶于阴虚有热，治当分别阴阳，不能概用温补，以免灼燥阴精，或滥用滋阴，遏制阳气。一般情况下宜阴阳并补，或有侧重，做到滋阴顾及阳气，壮阳不伤阴精。
    实验采用四种中药单体：白藜芦醇、枸杞多糖、槲皮素以及L-肉碱组成复方制剂，以调补阴阳为主，结合活血化瘀。枸杞多糖具有滋补肾阴作用，槲皮素具有温补肾阳作用。黄晓兰[8]等研究证实枸杞多糖能明显减轻大鼠睾丸组织细胞的损伤程度,同时能使降低的血清T水平明显升高，增加睾丸、附睾的脏器指数，显著增强SOD（超氧化物歧化酶）活性，降低MDA（丙二醛）含量，提高抗氧化能力；Ladachart Taepongsorat［9］等通过动物试验发现：槲皮素能使睾丸和附睾的重量明显增加，使精子质量和密度明显提高，且呈现出剂量和治疗持续时间的依赖性。白藜芦醇具有活血化瘀如消除自由基、消炎、改善微循环等作用。姜永光［10］以SD大鼠睾丸生精障碍模型为对象，以不同浓度的白藜芦醇灌胃治疗9周，各组大鼠外表体征得到恢复，接近正常组，同时c-kit蛋白重新获得表达。L-肉碱在精子能量代谢中起着关键性作用：如启动精子运动、促进精子成熟和提高精子受精能力，调节Serto1i细胞功能，保护精子对抗活性氧诱导的氧化损伤,减少生精细胞凋亡,抑制精子聚集等[11]。白藜芦醇[12]和槲皮素[13]又具有植物雌激素样作用。研究表明[14]：其生物效应约相当于雌二醇的10-3～10-5，具有较弱的雌激素和抗雌激素活性的双重作用。在内源性雌激素水平较低时, 它可与雌激素受体相结合, 表现出雌激素激动剂的作用, 而在内源性雌激素水平较高时, 它则竞争结合ER, 表现出抗雌激素作用。通过以上作用，可使升高的E2水平和降低的T/ E2比值恢复正常。
    从本实验结果来看，灌药各组的小鼠体重、睾丸重量及睾丸指数均较造模对照组有所改善，且表现出一定的量-效关系，其中中剂量组〔80mg/(kg·d〕〕各指标均组接近正常组（P >0.05），而低剂量组和高剂量组与正常组相比仍有差异（P<0.05）。生殖激素水平的改善，也以中剂量组改善最明显，血清T水平及T/ E2比值均有显著提高并接近正常组(P>0.05），而E2水平较造模对照组明显下降（P<0.05），同时使升高的FSH、LH恢复正常，为正常生精过程的启动与维持提供一个协调的内分泌微环境。表明该中药单体复方制剂不仅具有促进受损的睾丸生精小管、支持细胞及间质细胞的再生，启动精子生成，从而恢复生育能力，而且具有一定程度的量-效关系，以80mg/(kg·d〕剂量效果最好，其内在机制仍需进一步探讨。
    c-kit受体是一种酪氨酸蛋白激酶受体, kit配体即干细胞因子,则是由位于小鼠第10染色体上的S位点(steel locus)编码,为c-kit受体的配体,能与之发生特异性的结合[15]。在小鼠睾丸,kit配体是由支持细胞分泌的,而c-kit受体则存在于A型精原干细胞上，并且c-kit受体可作为A型精原细胞的标记物[16]。Yoshinaga等[17]报道,小鼠睾丸中c-kit受体的表达,在A1~A4型精原细胞为高水平;在B型及早期的前细线期精母细胞为低水平;在后期的精母细胞及精子细胞中不表达。造模对照组大部分生精小管中c-kit染色呈阴性，而各灌药组均有c-kit不同程度的表达，且可以见到一定数量的精子细胞和成熟的精子。由此可以看出，中药单体复方制剂通过促进生精干细胞的恢复而达到恢复小鼠生精功能的作用。

参考文献
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