先天性巨结肠--省科技进步二等奖

先天性巨结肠基础与临床的系列研究

中国医科大学附属盛京医院小儿外科

卫生部小儿先天畸形重点实验室

王维林  张树成  白玉作  高红 王伟  张志波 黄英 曲日斌 王练英

一、     立题依据中国医科大学附属盛京医院小儿外科张树成

 先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease, HD）是儿童期最常见的先天性消化道畸形之一，发病率约为1/5000~1/2000。其最主要的病理改变是结肠远端肠壁内神经节细胞缺如；临床表现为慢性便秘，严重影响儿童的生理发育。在80年代早期，由于人们对HD的认识尚不完善，HD的病死率相当高，随着科学技术的不断进步和学者们对HD病因病理的探索，目前HD的病死率几乎为零，尤其是近年来微创技术的飞速发展，为巨结肠的治疗带来了突破性的进展。但由于先天性巨结肠发生的多因素性和病理改变的复杂性，虽然多数病例治疗后效果满意，但是部分病例术后仍存在不同程度的排便功能障碍，严重影响患儿的身心健康和生活质量，给患儿家庭和社会带来沉重的负担。因此对于HD有待更深一步的研究。

首先是病因病理等基础方面，随着分子生物学技术的高速发展，应用基因芯片，PCR等技术对HD致病基因进行筛选和鉴定，确定其候选基因，一方面可以对HD的发病机理进行完善，另一方面还可以针对这些候选基因，在产前进行筛查，如果有条件还可以同时进行基因治疗，以达到早期预防，早期诊断和早期治疗的目的。同样对于HD病理改变的研究目的也不仅仅在于探讨其病因，更重要的是可以指导临床治疗，尤其是对于术后部分病例存在的排便功能障碍，发病机制普遍不清，治疗效果也不尽人意，因此如果能对这些改变的病理改变进行研究，因病施治，对因处理，相信效果能更加满意。

其次是临床治疗方面，关于HD的治疗，目前外科手术是普遍认可的方法，而且多数效果满意，尤其是1998年以后，经肛门一期根治术的建立使HD的外科治疗趋于大同，但是即使如此，部分病例的排便功能障碍问题仍然没有解决，严重影响患儿的身心健康和生活质量。为了减轻或者根除患者的病痛，首先就要对患者的排便情况，排便相关因素的状态有个清醒的认识，对于各种排便功能障碍的类型、程度进行正确的评估，对于制定针对性地治疗策略以及预后的评价都具有重要的意义。

    本研究从九十年代初开始，在国家自然科学基金，省部级基金资助下对HD的上述关键课题从基础到临床进行系列研究，旨在对HD的胚胎发育、病理改变和术后功能学改变进行深入研究，全面了解排便功能障碍给患儿、家长乃至整个社会带来的严重影响，为针对病因进行孕前及产前干预及预防提供依据。对HD术后制定针对的治疗措施，这对于降低出生缺陷，加强人口素质，提高生活质量具有重大意义。

二、    国内外同类研究的现状与比较

1. HD致病候选基因的筛选和鉴定

     关于HD致病候选基因的研究一直是本领域得研究热点，早在80年代，学者们就已经开始尝试用原始的PCR技术对HD的候选基因进行筛选，但由于受到技术水平的限制，所得结果单一，而且人力物力财力耗费较大，随着分子生物学的高速发展，PCR－SSCP，PCR－DGGE，DNA测序等新技术手段的不断涌现和广泛应用，为HD候选基因的研究提供了新的契机，学者们通过大量的实验初步筛选出与HD发病有关的若干基因，比如RET，Pax3, Sox10, EDNRB等，Angrist M发现先天性巨结肠中RET的突变频率低，提示先天性巨结肠的易感性与其它的遗传因素和环境因素相关，RET的基因型与病变表型间无明显关系。Lang D研究表明Pax3通过Sox10激活c-RET基因的表达，该基因常在HD中变异。本研究自90年代 开始，在国内率先应用PCR－SSCP技术对RET基因在巨结肠中的表达进行分析，发现中国散发HD长段型有RET 基因突变, 进而推测原癌基因RET 与先天性巨结肠症的发生有关。

    SIP1（Smad-interacting protein 1）是一个Smad相互作用的、有多个锌指结构的蛋白，属于δEF1家族成员，具有特异性DNA结合活性。SIP1由位于2q22区的ZFHX1B基因编码，是国外近几年才开始研究的与HSCR相关的基因。有报道在HSCR合并智力发育障碍、小头颜面畸形的患者中发现了ZFHX1B（SIP1）的基因突变。Amiel等研究了19例HSCR合并智力发育障碍的患者，发现其中8例存在大片段的SIP1基因缺失或提前出现终止密码子。 Nagaya等]在综合征性HSCR患者中也发现SIP1基因的突变，并且大多发生于SIP1基因的第八外显子。故SIP1基因是研究HSCR遗传因素的热点。我们应用PCR-SSCP和DNA直接测序技术，对50例HSCR病例、30例正常健康人外周血SIP1基因编码区的10个外显子，进行了点突变与单核苷酸多态性的检测与分析，发现HSCR有SIP1基因突变，提示SIP1基因与HSCR的发病存在一定程度的关联。

2. HD的发病机制和病理形态基础

     HD最主要的病理改变是结肠远端肠壁内神经节细胞缺如，但是造成本变化的原因至今尚不清楚，目前存在诸多学说，比较统一的是肠神经嵴干细胞迁移学说，认为神经节细胞缺如的根本原因是胚胎发育阶段肠神经嵴干细胞迁移，分化或增殖障碍。任何引起肠神经嵴干细胞迁移，分化或增殖障碍的病理改变均可能导致HD的发生。因此学者们对发病机制和病理形态基础进行了大量地探索，并取得了令人瞩目的成绩。Bondurand N等研究发现SOX10和endothelin3信号系统在HD中的表达异常，提示该信号在维持肠神经系统的持续分化增殖方面意义重大，可能参与了HD的发生。Anderson RB等发现，细胞外基质成分如细胞黏附分子11，层粘连蛋白(laminin)，纤粘连蛋白(fibronectin) 等在巨结肠时表达缺失，可能与诱导肠神经嵴干细胞迁移障碍有关，因此也可能参与了HD的发生。神经营养因子及其受体家族是近年来研究较多的热点之一，可能与神经元的发育成熟有关，为神经元发育所必需，其表达异常可能导致神经元的营养障碍，坏死，产生神经节细胞缺如。根据这一假说，本研究较早在国内应用免疫组化，RT-PCR等技术应用RT-PCR技术探讨神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)及其受体(nervegrowthfactorreceptor，NGFR) 基因以及P75NGFR在先天性巨结肠中的表达及其对先天性巨结肠的调控作用，发现NGF和NGFR，P75NGFR与HD病理形态有相关性；提示NGF和NGFR，P75NGFR可能与HD的发生有关。并在近年的研究中应用RT-PCR技术率先发现，巨结肠肠壁组织内C-fos原癌基因，Pax3和Cx43基因突变及表达异常，Pax3和Cx43基因突变造成信息传递缺陷，扰乱了神经嵴细胞的迁移，可能参与了HD的发生。

3. HD的外科治疗和术后排便功能评定

关于HD的治疗，目前外科手术是普遍认可的方法，而且多数效果满意，尤其是1998年以后，经肛门一期根治术的建立使HD的外科治疗趋于大同，该术式的最大优点是创伤小，腹部无切口瘢痕，无开腹手术并发症，因此受到广大患者和医生的欢迎，国内外多个医疗中心纷纷开展，本研究从1999年开始在东北地区率先应用该术式治疗HD，取得了良好的群众满意度，创造了巨大的社会效益和经济效益。

虽然多数病例手术治疗取得了令人满意的效果，但不容忽视的是，少数病例发生的排便功能障碍问题仍然没有解决，如污便，便秘和便失禁问题，仍然是困扰部分患者的顽疾。为了正确解决这一问题，首先就要对患者术后的排便功能进行正确的分析和评定，确定排便功能障碍的类型和程度，才能因病施治，制定针对的治疗措施。因此，学者们对HD根治术后患者排便功能进行了大量的调查研究，证实术后患者确实存在不同程度的排便功能障碍，Elhalaby EA等对来自6个医学中心的141例HD经肛门根治术后患者进行随访发现，与传统术式相比，虽然经肛门一期根治术具有创伤小，腹部无切口瘢痕等诸多优点，但是术后排便功能障碍的问题，并没有很大的改观，便秘便失禁的发生率没有明显降低。国内高亚等人也得出了类似的结果。Yanchar NL等人对HD术后远期的功能进行调查发现，便秘便失禁仍然是影响患者身心健康的主要并发症。虽然国内外十分重视HD术后随访和术后肛门功能评定，但大多数仅限于术后排便功能分析统计。在排便功能客观检测方面的研究主要限制在单一的检测方法，如直肠肛管测压或排便造影等。本课题组自2000年对346例HD外科术后病人进行大样本随访，率先采用临床功能评定与代表肛门内括约肌功能的直肠肛管测压、代表肛门外括约肌功能的肌电图及代表耻骨直肠肌功能的X线钡灌肠检查等多项客观检测相结合综合评价排便功能。首次建立了一种临床评分与客观评分相结合的肛门功能综合评分标准，克服了过去以往评价指标的主观性和局限性，更新和发展了肛门功能评定的概念，为改进治疗方法，提高疗效提供了重要依据。除本课题组发表的文献外，国内未见如此大样本的随访研究报道，并在国内外率先应用结肠传输实验检测患者的结肠功能，提出HD术后排便功能障碍与乙状结肠曲减少或消失、“新直肠”储便功能代偿不全和拖出结肠致直肠肛管角开大有关。

4. HD术后远期生活质量评定

生活质量（Quality of life，QOL）是现代医学评价健康的全新指标，包括身体、心理和社会等方面的综合评估。目前国内尚未见HD术后患儿生活质量评估的报道。国外该方面研究均侧重于身体、心理或社会单一方面的研究，而且缺乏8岁-16岁年龄组的报道。本课题首次应用自行设计的问卷和标化的儿童行为量表对HD术后患儿远期生活质量从身体、心理和社会等方面进行综合调查和评估，并初步提出了8岁-16岁（学龄儿和年长儿）排便功能障碍的生活质量评定标准，为进一步制订康复对策提供了依据。在国内首次对HD术后远期病人进行生活质量观察，发现由于HD术后排便功能障碍严重影响其工作和生活，影响病人的一生。因此提出“外科治疗畸形的目的不仅仅在于手术的解剖重建，更要重视手术后的功能重建和远期生活质量的提高”理论。

三、    主要技术工作

（一）HD致病候选基因的筛选和鉴定

1.RET原癌基因

选取30 例中国散发HD，提取基因组DNA; 应用聚合酶链反应(PCR) 扩增RET 基因第6、13、15、17 外显子; 单链构象多态(SSCP) 分析上述外显子是否有突变。结果显示6例长段型, 2 例有RET 基因突变，普通型及短段型未见RET 基因突变。2 例突变位点均是RET 基因的第13 外显子。国内率先发现中国散发HD长段型有RET 基因突变, 进而推测原癌基因RET 与先天性巨结肠症的发生有关。

2．SIP1基因

 应用PCR-SSCP和DNA直接测序技术，对50例HD和30例正常健康人外周血SIP1基因编码区的10个外显子，进行点突变与单核苷酸多态性的检测与分析，发现有1例病例在第7外显子与正常健康人突变图谱比较出现杂合性缺失，检测到密码子157位点GTG→GTA的置换，引起亮氨酸的同义突变，属于单核苷酸多态性，突变率为2%（1/50）。有4例病例在第8外显子出现突变，突变率为8%（4/50）。PCR-SSCP银染分析,第2外显子2例出现相同类型泳动变位；第7外显子3例出现相同类型泳动变位；第8外显子7例出现相同类型泳动变位。进而在国内外率先发现HSCR有SIP1基因突变，推测SIP1基因与HSCR的发病存在一定程度的关联。

（二）HD的发病机制和病理形态基础

1．神经营养因子受体P75NGFR

应用免疫组化技术对30 例HD 患儿肠壁组织中P75NGFR的分布情况进行检测，发现正常肠段的粘膜固有层和粘膜肌层中有大量的P75NGFR 阳性纤维, 粘膜下和肌间神经丛中神经节细胞表现为P75NGFR强阳性, 痉挛段肠管粘膜固有层和粘膜肌层中P75NGFR 阳性纤维明显减少或缺如, 粘膜下和肌间粗大神经纤维的神经束膜表现为P75NGFR 强阳性, 象一个环包绕在周围。进而在国内较早提出P75NGFR在HD 痉挛段中的异常分布可能与HD 的发生有关。

2．RET和GDNF蛋白表达

以免疫组化方法观察21例HD患者和5例正常对照的全层肠标本，发现在对照组结肠与HD正常段肠管肌间丛、粘膜下丛神经节细胞胞浆可见RET和GDNF蛋白抗体强阳性染色；移行段神经节细胞染色强度弱于正常段神经节细胞；痉挛段肌间丛、粘膜下丛无RET和GDNF蛋白阳性细胞；在HD正常段、移行段肠管粘膜腺体上皮细胞胞浆可见GDNF蛋白红染，多位于腺腔上中部，肌间丛内细胞间有抗GDNF蛋白阳性染色。进而在国内首先发现RET和GDNF蛋白在HD正常段、移行段与痉挛段表达逐渐减少，与HD肠神经节细胞缺乏相吻合， HD病变肠段既存在酪氨酸激酶受体的缺陷，也可能存在神经营养因子的异常。推测RET和GDNF蛋白异常可能与HD的发生有关。

3．神经生长因子及其受体

  　采用RT-PCR技术检测22例新鲜HD肠壁组织标本对照肠管、痉挛段、移行段和扩张段各NGF和NGFR mRNA的表达，发现21 例NGFmRNA表达阳性(95. 5%)，20例NGFR mRNA表达阳性(90. 9%)；痉挛段5例NGF mRNA表达阳性(22. 7%)，6例NGFR mRNA表达阳性(27. 3%)；移行段9例NGF mRNA表达阳性(49. 9% )，7例NGFR mRNA表达阳性(31. 8%)；扩张段18例NGF mRNA表达阳性(81. 8% )，19例NGFR mRNA表达阳性(86. 4% )。NGF和NGFR mRNA正常肠管与扩张段肠管中表达高度一致；痉挛段和移行段均为NGF mRNA和NGFRmRNA低表达。进而发现NGF和NGFR与HD病理形态有相关性， HD的痉挛段和移行段肠管NGF及NGFR表达异常，推测NGF和NGFR基因可能与HD的发生有关。

4． c-fos原癌基因的表达

    采用RT-PCR技术及免疫组织化学方法对巨结肠无神经节细胞的痉挛段以及有神经节细胞的扩张段、正常段各12例标本C-fos原癌基因mRNA的和蛋白表达情况。发现无神经节细胞的痉挛段C-fos mRNA表达水平明显高于有神经节细胞扩张段近端（痉挛段相对含量2.11±0.09,扩张段相对含量0.55±0.06，单位：mass），巨结肠扩张段近端与正常组织相比无明显差异；C-fos蛋白免疫组化巨结肠无神经节细胞的痉挛段黏膜固有层和黏膜肌层中出现大量的棕褐色C-fos蛋白表达产物，而巨结肠扩近端的扩张段未见C-fos蛋白表达阳性产物。进而在国内外率先发现C-fos mRNA表达及C-fos蛋白表达异常可能参与先天性巨结肠的发病机制，可能与C-fos基因可能参与了神经节细胞的损害有关。

5．PITX2/HOX3.5基因，Pax3和Cx43基因

应用RT-PCR技术分别对22例新鲜HD肠壁组织标本对照肠管、痉挛段、移行段和扩张段PITX2/HOX3.5基因，Pax3和Cx43基因mRNA的表达情况进行检测，发现PITX2/HOX3.5基因，Pax3和Cx43基因mRNA在HD患者肠壁中的表达存在异常，并在国内外率先提出先天性巨结肠的发病可能与PITX2/HOX3.5基因，Pax3和Cx43基因的表达异常有关，原因是PITX2/HOX3.5基因，Pax3和Cx43的异常可能影响胚胎发育、神经节细胞发育不全或者扰乱了神经嵴细胞的迁移，因而参与了HD的发生。

6．巨细胞病毒感染与HD关系的系列研究

人巨细胞病毒（HCMV）是引起胚胎期先天发育畸形的最常见的病毒之一，早在90年，我科即应用PCR技术对22例新鲜HD肠壁组织标本中的HCMV进行检测，较早发现HCMV感染与HD的发生有一定关系，在标本中成功分理出HCMV病毒株，并在以后进行的一系列研究中，通过对53例HD患者肠壁组织中HCMV进行荧光定量PCR检测，并应用巢式PCR扩增UL144基因开放阅读框并测序，结果发现HD患儿DNA基因序列分为3个基因型，即G1A，G2，G3；在国内外率先发现HD与HCMV感染有关，HCMV感染可能是HD的病因之一。

（三）HD的外科治疗和术后排便功能评定

1．传统手术术后远期排便功能调查与评定

对从1980-1996年间因HD在我院行传统Swenson根治术的346例HD患者术后远期（5-20年）的排便功能进行随访，并结合钡灌肠、排便造影、结肠传输时间、肛门直肠向量测压等客观检查技术对患者的结肠功能和括约肌功能进行评定，发现传统的Swenson手术后远期患者存在不同程度的排便功能障碍，通过评定发现可能与患者的结肠或括约肌功能异常有关。关于HD术后远期排便功能国内未见如此大样本的随访研究报道，并在国内外率先应用钡灌肠、排便造影、结肠传输时间、肛门直肠向量测压对HD术后远期结肠功能和括约肌功能进行客观评定。

2．手术术式及术后排便功能调查：经肛门一期根治术（POOP）

自1999年开始对在我院儿童普外科，新生儿外科住院的76例HD患儿行经肛门一期根治术（POOP），率先在东北地区开展应用此手术方式，并在实际工作中对该术式进行改进，获得满意效果，为巨结肠治疗上的革命性突破。对术后患者的切口，开腹瘢痕，住院时间，出血量等指标进行比较，证实该术式对于HD的实用性和优越性；并在以后的系列研究中，较早的对该术式术后远期儿童的排便功能进行调查，发现多数患者术后的排便功能满意，经肛门一期根治术治疗普通型HD是安全的有效的。在国内外较早的发现术后排便功能随时间逐渐恢复，病变肠段越长，恢复越慢。

3．HD手术前后的结肠功能评定

在国内外率先应用体表结肠电图对16例HD和11例正常儿童术前的结肠生物电活动进行检测，发现巨结肠儿童的肠电图有异常波，表现为无波、偶发波及微小波出现，它可作为诊断巨结肠的客观指标，同时根据异常波型出现部位可做为判断巨结肠类型的参考指标。

在经肛门一期根治术广泛应用以后，我们在对术后排便功能调查的同时还联合应用钡灌肠和结肠传输试验对76例HD患儿术后的结肠功能进行客观评定，在国内外率先应用物理检查对经肛门一期根治术后的结肠功能进行客观地分析和评定，并通过检查率先发现绝大多数患儿术后的结肠功能恢复良好，部分病例存在结肠功能异常，表现为乙状结肠曲减少或消失、“新直肠”储便功能代偿不全和拖出结肠致直肠肛管角开大，可能与少数病人的排便功能障碍有关。

4．HD手术前后肛门括约肌功能评定

应用经会阴超声技术对1985～1995 年在我院因先天性巨结肠行根治术的54例患儿肛门括约肌厚度进行观察，在国内较早的发现，HD术后功能障碍患者的括约肌厚度明显变薄，而排便功能正常患儿的括约肌与正常儿童无差异，进而推测HD术后排便功能于术后肛门括约肌的厚度有关。

另外，我们还应用肛门直肠三维向量测压技术对58例经肛门一期根治术和42例Swenson术后儿童的肛门括约肌功能进行检测发现，无论手术方式如何，术后排便功能有污便和失禁表现的儿童，其向量容积和对称指数均较正常儿童和排便功能良好儿童低，在国内率先证实HD术后排便功能与肛门括约肌的功能状态有关。

（四）HD术后远期生活质量评定

应用自行设计的问卷和标化的儿童行为量表对45例Swenson术后患儿远期生活质量从身体、心理和社会等方面进行综合调查和评估，包括排便功能、饮食睡眠、上学情况、运动娱乐、同伴交往和家庭关系等18项内容的问卷调查，全面评估肛门直肠畸形术后远期生活质量。具体表现为术后便失禁小儿饮食受限、缺课退学、同伴交往受限，行为问题异常等。结果显示虽然Swenson术后多数患者的生活质量令人满意，但是部分患者存在便秘、污便和便失禁等排便功能障碍，严重影响患者的生活质量，甚至影响病人的一生。在调查研究的基础上，在国内率先提出了外科治疗畸形的目的不仅仅在于手术的解剖重建，更要重视手术后的功能重建和远期生活质量的提高”的理论。

四、技术创新点

1．在东北地区率先应用经肛门巨结肠根治术治疗先天性巨结肠，并在实际工作中对该术式进行改进，获得满意效果，为巨结肠治疗上的革命性突破。2．在国内首次对先天性巨结肠术后患者排便功能进行大样本的随访，发现巨结肠无论是传统手术还是经肛门根治术术后患者均存在不同程度的排便功能障碍。

3．国内外首次将结肠传输试验，动态排便造影和结肠电图技术用于先天性巨结肠术前术后结肠功能评定，发现部分巨结肠患者术后远期结肠存在传输功能异常，结合动态排便造影技术创造性提出巨结肠术后部分患者发生的排便功能障碍可能与乙状结肠曲减少或消失、“新直肠”储便功能代偿不全和拖出结肠致直肠肛管角开大有关。

4．国内首次联合应用多维向量测压和会阴超声技术对巨结肠术后肛门括约肌的形态和功能进行评价，发现巨结肠术后肛门括约肌形态基本正常，但功能上存在不同程度异常。巨结肠术后的排便功能障碍与肛门括约肌痉挛失迟缓或损伤有关。

5．国内外首次对巨结肠Swenson术后患者的远期生活质量进行调查评估，发现虽然Swenson术后多数患者的生活质量令人满意，但是部分患者存在便秘、污便和便失禁等排便功能障碍，严重影响患者的生活质量，提出“外科治疗畸形的目的不仅仅在于手术的解剖重建，更要重视手术后的功能重建和远期生活质量的提高”理论。

6．人类先天性巨结肠某些致病基因研究填补该研究领域的空白。

①应用免疫组化、RT-PCR和PCR-SSCP技术对RET、C-fos原癌基因在巨结肠中的表达进行分析，发现先天性巨结肠有RET、C-fos基因表达，提示RET、C-fos原癌基因与先天性巨结肠的发生有关。

②应用RT-PCR和PCR-SSCP方法检测Pax3和Cx43基因在先天性巨结肠中突变及表达，发现巨结肠Pax3和Cx43基因突变及表达异常，Pax3和Cx43基因突变造成信息传递缺陷，扰乱了神经嵴细胞的迁移，从而导致HD的发生。

③应用RT-PCR技术探讨神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)及其神经生长因子受体(nervegrowthfactorreceptor，NGFR) 基因在先天性巨结肠中的表达及其对先天性巨结肠的调控作用，发现NGF和NGFR与HD病理形态有相关性；HD的痉挛段和移行段肠管NGF及NGFR表达异常，提示NGF和NGFR基因可能与HD的发生有关。

7．较早的对先天性巨结肠神经病理进行系统研究，居国内领先。应用免疫组化技术对神经生长因子受体P75NGFR在先天性巨结肠中的分布进行研究，发现P75NGFR在痉挛段中分布异常，提示P75NGFR与先天性巨结肠的发生有关，P75NGFR可以作为巨结肠诊断的重要方法之一。

五、推广应用情况

本研究成果从1996年陆续通过举办国家及省级继续医学教育学习班方式推广，至2004年已经累计举办学习班8期，累计学员300余名，来自北京、广州、湖南、湖北、山东以及省内各市级医院，并获得推广应用。

本课题先后获国家自然基金2项，省部级基金2项，加上学校和医院学科投入，总研究经费约80余万元，共有30篇论文在国内外核心杂志发表，被SCI收录3 篇。主编专著2部。培养博士研究生12名，硕士研究生24名。

主办中华小儿外科杂志排便功能障碍专号（1999年第5期）和中国实用儿科杂志小儿排便功能障碍专刊(1997年第3期)。

国际、国内核心杂志发表的主要论著

1.       Zhang SC, Bai YZ, Wang W, Wang WL. Long-term outcome, colonic motility, and sphincter performance after Swenson's procedure for Hirschsprung's disease: a single-center 2-decade experience with 346 cases. Am J Surg, 2007,194(1):40-47

2.       Zhang SC, Bai YZ, Wang W, Wang WL. Stooling patterns and colonic motility after transanal one-stage pull-through operation for Hirschsprung's disease in children. J Pediatr Surg. 2005，40(11):1766-72.

3.       Zhang SC, Bai YZ, Wang W, Wang WL. Clinical outcome in children after transanal 1-stage endorectal pull-through operation for Hirschsprung disease. J Pediatr Surg. 2005 ，40(8):1307-11.

4.       Zhang SC, Bai YZ, Wang W, Wang WL. Evaluation of anorectal function after transanal one-stage endorectal pull through operation in children with Hirschsprung's disease. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2007 ，9(3):188-92.

5.       Bai Y, Chen H, Hao J, Huang Y, Wang W. Long-term outcome and quality of life after the Swenson procedure for Hirschsprung's disease. J Pediatr Surg. 2002 ，37(4):639-42.

6.       张树成, 王维林，白玉作，王伟。经肛巨结肠根治术后结肠功能的初步评价。中华普通外科杂志，2006/03

7.       张树成，曲日斌，王维林，白玉作，王伟。婴幼儿经肛巨结肠根治术后肛门括约肌向量测压研究。中华普通外科杂志，2006/05

8.       张树成, 王维林，白玉作，王伟。经肛巨结肠根治术后肛肠功能评价。中华小儿外科杂志，2006/03

9.       张树成, 王维林，白玉作，王伟。经肛巨结肠根治术后临床排便功能调查及评价。中国医科大学学报，2006/01

10.   高红，王恩波，张志波，王维林，王练英。同源异型框基因在先天性巨结肠中的表达。中华小儿外科杂志，2007/07

11.   高红, 张志波，王维林，黄英。先天性巨结肠神经生长因子及神经生长因子受体基因表达。中华小儿外科杂志， 2005/03

12.   高红, 张志波，王维林，黄英。先天性巨结肠Pax3和Cx43基因突变及表达。世界华人消化杂志， 2004/09

13.   郝晶, 李旭，李心元。先天性巨结肠术后远期排便功能与生活质量。临床儿科杂志， 2004/06

14.   郝晶, 黄英，白玉作，李心元，王维林。先天性巨结肠Swenson’s改良术后远期生活质量的评估研究。临床小儿外科杂志， 2004/03

15.   黄丽萍, 王冰。经会阴超声对巨结肠术后肛门直肠功能的评价。中华超声影像学杂志， 2003/09

16.   王维林, 郝晶，白玉作，黄英。先天性巨结肠Swenson改良术后排便功能与生活质量研究。中华小儿外科杂志， 2003/02

17.   张树成, 王维林，白玉作，袁正伟。先天性巨结肠术后结肠传输时间测定的意义。中华小儿外科杂志， 2003/02

18.   牛之彬, 王练英。小婴儿I期经肛门巨结肠根治术。临床小儿外科杂志， 2002/03

19.   吴术芬, 刘军。经肛门行巨结肠根治术的护理。现代护理， 2002/09

20.   王伟, 白玉作，王维林，郝晶。先天性巨结肠术后直肠肛管向量测压的研究中国医科大学第二临床学院小儿。中华小儿外科杂志， 2002/03

21.   高红, 白玉作，刘宏宇，孔娟，景宏兵。先天性巨结肠症C-fos原癌基因表达的研究。 中华消化杂志， 2000/04

22.   毛志芹，,黄英。先天性巨结肠患者人类巨细胞病毒UL144基因多态性的研究。中华微生物学和免疫学杂志，2006/04

23.   李华庆, 李心元。先天性巨结肠的严重并发症——小肠结肠炎。 岭南现代临床外科， 1998/02

24.   王练英,徐建军，李正，陈晓凯。先天性巨结肠病儿的肠电图改变。辽宁医学杂志， 1998/01

25.   于明。先天性巨结肠的诊断与治疗。实用乡村医生杂志， 1998/06

26.   王夫,牟雪松，王惠贞。先天性巨结肠P~(75NGFR)的免疫组化研究。中华小儿外科杂志， 1998/05

27.   武君, 王慧贞，吉士俊，张学。先天性巨结肠症原癌基因RET结构的PCR-SSCP分析。中华小儿外科杂志， 1998/04

28.   吕晶, 李国福。婴儿先天性巨结肠67例手术的麻醉管理。辽宁医学杂志， 1997/03

29.   王练英, 徐建军，李正，陈晓凯。先天性巨结肠病儿的肠电图改变。大肠肛门病外科杂志， 1997/02

30.   王夫。先天性巨结肠及其同源病的诊断。中国实用儿科杂志 1997/03

31.   王练英, 李正，陈士洁，王亚柱，门永继。小婴儿先天性巨结肠围手术期外周血T淋巴细胞亚群和体液免疫观察。 大肠肛门病外科杂志， 1996/04

32.   武君。先天性巨结肠与原癌基因RET。中华小儿外科杂志， 1996/01

33.   王练英, 李正。婴儿先天性巨结肠与巨细胞病毒感染。中华小儿外科杂志， 1996/01

六、存在问题

目前该领域存在的问题是：对ENS发育异常的判定缺乏普遍认可的标准，而这种判定又直接关系到实际工作中疾病的诊断和处理，诊断上一点点的不同对结果会造成巨大的影响。由于目前医患关系不和谐，直接导致的结果就是多数医生在处理问题时采取保守态度，对有疑问的疾病回避治疗，疾病的诊治水平整体落后，由此可见解决问题的必要性和迫切性；比如慢传输性便秘的患者多数存在ENS的发育异常，但是因为没有确切的诊断标准，因而无法做出相应的处理，这也就是便秘处理困难的重要原因之一；再如在先天性巨结肠及类缘病的手术中，如何来确定手术切除肠管的范围？首先就要对正常和异常的界限进行判定，这无论对手术的成败还是术后排便功能的恢复都是至关重要的。可见，正确地解决上述问题对诊断和治疗都具有重要的临床意义。下一步我们将应用二维双向电泳技术对ENS发育的形态学标记进行了探索，力图发现对肠神经系统发育成熟度有诊断意义并且可以通过简单的形态染色进行区分的新的特异性蛋白分子标志物，为临床医生的诊治提供依据。

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